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胡璐璐/刘杰/何川等团队相助开发：使用航行时间核酸质谱定量检测超微量样本中核酸表观修饰的新要领LAMP-MS
腾龙国际客服 宣布时间：2024-11-22 腾龙国际客服 泉源：微信公众号 腾龙国际客服 浏览量：2782

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2024年11月4日 ，国际化学类顶级期刊《德国应用化学国际版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上揭晓了题为《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究论文 。报道了一种基于核酸质谱平台的立异甲基化检测要领 ，该事情由复旦大学医学院胡璐璐研究员团队、西岳医院消化科刘杰主任团队、美国芝加哥大学何川院士团队携手柏锘（上海）医疗科技有限公司配合完成 。

该研究中所使用的航行时间质谱平台为腾龙国际客服科技生命科学板块旗下聚致生物（GenWish）自主研发的GeneTOF 3100核酸质谱剖析系统 。

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液体活检手艺通过网络血液中来自种种组织的游离DNA（cfDNA） ，对其中包括的生物标记物（如基因突变、甲基化或羟甲基等表观修饰）举行检测 ，具有无创、高效的特点 。与古板的种种检测手艺（例如胃肠镜、血清标记物）相比 ，液体活检在临床上具有革命性的优势 ，在癌症等疾病的早筛早诊、预后监测、疗效评估等诸多方面有辽阔的应用远景 。

DNA甲基化作为一种主要的表观遗传修饰 ，可在肿瘤爆发的早期被检测到 ，且具有较好的稳固性 ，因此成为肿瘤液体活检中一个极具价值的生物标记物 。可是 ，现在基于亚硫酸氢盐测序手艺的甲基化检测要领 ，很难阻止DNA的降解 ；且高通量测序本钱较高 ，实验后的剖析事情重大 ；PCR检测涵盖的位点也有限 ，因此开发一种经济、可靠、通量无邪且能够笼罩多位点的新甲基化检测要领 ，是很是具有意义的 。

研究团队开发的LAMP-MS要领创立性地将线性扩增和航行时间质谱手艺团结在一起 ，只需要1ng血浆cfDNA ，通过多重PCR和单碱基引物延伸 ，能够在较短时间内同时检测数十个甲基化位点 。该手艺主要操作办法如图1所示：

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LAMP-MS的完整事情流程

  • 从血浆中提取1ng的cfDNA样本 ，经由最后修复后 ，用含有甲基化双链T7启动子的DNA讨论举行毗连 ；

  • 举行亚硫酸氢盐处置惩罚后 ，非甲基化的胞嘧啶（dC）转化为尿嘧啶（dU） ，而甲基化的胞嘧啶（5mC）坚持稳固 ；

  • 使用T7 RNA聚合酶举行无偏好性线性扩增 ，爆发μg数目级的RNA产品 ；

  • 逆转录爆发微克水平的cDNA ；

  • 通过序列特异性PCR对含有特定DNA甲基化位点的DNA片断举行指数扩增 ；

  • 对特定的DNA片断举行文库构建和浅测序（1~2G深度） ，称为靶向LAMP-Seq ，以确定5mC的化学计量 ；

  • 使用位点特异性引物举行单碱基延伸 ，若是延伸位点配对的是ddATP ，代表此处为未甲基化的C ，若是是ddGTP则代表甲基化的5mC ，通过响应的质谱峰盘算 5mC/C 比值 。

为验证LAMP-MS要领的性能 ，研究团队合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探针混淆物 ，使用1ng的上述探针混淆物对LAMP-MS要领举行测试 。效果批注 ，LAMP-MS能够准确地定量丈量从0%到100%的5mC（图2A） ，图2B中标曲批注检测准确性和理论值高度吻合 。别的 ，文章体现 ，LAMP-MS在1ng探针混淆物系统下的检测限为5%的5mC的甲基化率（图2B） 。

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图2A 使用1ng 5mC探针验证LAMP-MS要领的迅速度和准确性

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图2B 使用1ng 5mC探针验证LAMP-MS要领的迅速度和准确性

在临床上 ，来自癌症患者血浆cfDNA样本的生物标记物品貌因人而异 ，因此研究团队进一步使用真实样本对LAMP-MS要领举行了验证 。从10名结直肠癌患者和10名非结直肠癌患者中各获取1ng的cfDNA样本 ，检测了却直肠癌筛查中最具有代表性的标记物——SEPTIN9基因的4个甲基化位点 ，发明LAMP-MS能够准确测定四个 SEPTIN9 位点的 5mC 甲基化率 ，且结直肠癌组和非结直肠癌组之间保存显著差别 ，与高通量测序效果有很好的一致性（图3） 。

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图3 在结直肠癌和非结直肠癌患者中验证LAMP-MS要领

研究团队以为 ，同样的战略也可以拓展到RNA的定量检测中 ，例如在大大都高等生物mRNA中含量最富厚、并且关于生命历程起着主要调理作用的m6A修饰的检测 。

研究团队将已揭晓的GLORI手艺和核酸质谱有机整合成为m6A Mass Array要领 。该要领从HELA细胞中提取mRNA ，将未甲基化的腺嘌呤转化为肌苷 ，甲基化的m6A则保存下来 。经由最后修复、加讨论 ，再将mRNA反转录成cDNA ，作为模板举行指数扩增 ，然后在m6A位点举行单碱基延伸 ，若延伸ddATP则对应检测位点为m6A ，ddGTP对应未甲基化的腺嘌呤 。从而能够盘算出该位点的 m6A/A 比率 。

比照HELA细胞mRNA中RXRA基因（100% m6A） ，TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A） ，及其各自相近的非甲基化腺嘌呤位点 ，证实该m6A核酸质谱要领能够举行有用的RNA甲基化定量检测（图4）  。

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图4 m6A核酸质谱要领：流程及验证

综上所述 ，LAMP-MS（及m6A MASS ARRAY要领）基于核酸质谱手艺 ，可以实现超低量样本的甲基化检测 ，且效果可以直接可视化 ，不需要高通量测序繁复的数据剖析处置惩罚历程 ；该手艺使用核酸质谱前处置惩罚系统 ，在单反应中可实现检测多个5mC位点的检测 ，且具有优异的特异性 ，在临床上可用于同时筛查多种癌症类型的标记物 ；并且 ，质谱检测也具有极高的迅速度和细密度 ，能够在极低样本量下提供高度可靠的剖析效果 ，是低品貌变异标记物检测的理想平台 ；最后 ，核酸质谱通量无邪 ，无需凑样 ，能够从容应对大样本量的临床验证事情或小样本量的研究事情 。

因此 ，LAMP-MS手艺有潜力作为表观遗传学领域主要的适用工具 ，为科研事情者的实验室研究和临床样本检测提供了经济且先进的应用计划 。

原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202413872


聚致生物核酸质谱平台

GeneTOF系列核酸质谱剖析系统是准确、经济、高效的多重自动化基因检测平台 ，能够在单反应中实现1~50个基因位点变异靶标的准确检测 ，变异类型包括SNP突变、甲基化、拷贝数变异、基因融合、碱基插入/缺失等 。在肿瘤防治、出生缺陷防控、药物基因组、病原体检测等领域具有普遍的应用 。

聚致生物

杭州聚致生物科技有限公司（简称“聚致生物”）建设于2021年 ，总部位于浙江杭州 ，是海内高端仪器装备领军企业——腾龙国际客服科技生命科学旗下子公司 ，专注于生物质谱类及相关仪器产品的研发、生产和推广 ，致力于以先进剖析手艺推动生命科学研究和工业的生长 ，共建优异的工业生态 。

聚致生物定位于上游仪器平台供应商 ，以开放的态度同生命科学领域的专业机构相助 ，配合培育终端应用市场 ，造福人类的优美生涯 。

聚致生物产品

GeneTOF系列 核酸质谱剖析系统

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MEC-1000 核酸片断剖析仪
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